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PrimerExplorerV3 操作説明
【1】はじめに (動作環境)
【2】各画面の操作通常プライマーの設計ループプライマーの設計
【3】付録
【4】PrimerExplorerV3 主なバージョンアップ内容
【5】LAMP法プライマー設計の手引き PrimerExplorerV3 [PDF(1.7MB)]
4. PrimerExplorerV3 主なバージョンアップ内容
1. プライマーセット設計方法の改修

デフォルトでターゲット配列全領域に対して5’末端方向から3’末端方向へ片寄りなくプライマーを設計・表示できるようになりました。

V2, V3でのプライマーセット設計方法は異なり、プライマーセットの表示結果は下記のようになります。

  • PrimerExplorerV2の場合
    (デフォルトのソーティングルール[F2 Position]を選択)
    1つのF2に対して、Limitation(F1c/B1c, F3/B3)で指定した数分だけプライマーセットを生成してから、次のF2に対するプライマーセットを生成しに行きます。
    そのためターゲット配列に対して、プライマーセット群の位置に偏りが生じてしまいます。
    PrimerExplorerV2の場合

  • PrimerExplorerV3の場合
    (デフォルトのソーティングルール[None]を選択)
    一方、V3では1つのF2候補に対してプライマーセットを生成できたら、次のF2候補に対するプライマーセットを生成します。
    そのため、ターゲット配列全体に偏りなくプライマーセットを生成できます。
    PrimerExplorerV3の場合
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2. ATリッチ、GCリッチ用のパラメータの追加
ターゲット配列を読み込む際、自動でAT/GCリッチを判別して対応するパラメータをセットできるようになりました。

PrimerExplorerV3では、ターゲット配列をアップロードする際に、自動でAT/GCを計算し、 対応するパラメータを設計画面上にセットさせることが可能です。 また、ユーザー指定ファイルを指定することも可能です。
 
 
PrimerExplorerV3で使用するパラメータセット
  通常 ATリッチ GCリッチ
Length(base) Min Max Min Max Min Max
F1c/B1c 20 22 20 25 15 22
F2/B2 18 20 18 25 15 20
F3/B3 18 20 18 25 15 20
Tm(℃)            
F1c/B1c 64 66 60 66 64 68
F2/B2 59 61 55 61 59 63
F3/B3 59 61 55 61 59 63
GC rate(%) 40 65 30 65 40 70
  AT/GCリッチ自動計算時には、ターゲット配列全体のGC含有率(%)により、下記のとおりパラメータを振り分けます。

通常 : 45 < GC < 60
ATリッチ : GC <= 45
GCリッチ : GC >= 60
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3. パラメータの保存

設計画面でパラメータを変更した際のパラメータを保存し、次回設計時に再利用できるようになりました。

  • "SaveParameter"ボタンを押すことで、
    設計画面上のパラメータセットをローカルの環境に保存できます。
    設定画面

  • 保存したファイルは、次回設計時にターゲットファイルと同時に、
    "ユーザー指定パラメータ"としてアップロードすることが可能です。
    保存したファイル
4. ターゲット配列に対するフィルタリング
F1c/B1cの5'端、F2/B2の3'端と相補的な配列がターゲット配列、もしくはその相補鎖配列に含まれる場合(自身の相補鎖は除く)、そのF1c/B1c、F2/B2をフィルタリングします。
5. 特殊配列のフィルタリング
***AAA、***TTT、***GGG、***CCCのようにF1、F2、F3、B1、B2、B3の3'末端3塩基が同じ塩基となったプライマーはフィルタリングします。(***は任意の塩基)
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6. 各プライマーに対するMutation/Consensus許容指定

各プライマーの5'端側、中間部位、3'端側へのMutation/Consensus指定が可能となりました。

<PrimerExplorerV2, V3のMutation/Consensus指定チェックボックスの比較>
下の図は、V2, V3それぞれにおけるMutation/Consensusを指定するチェックボックスです。

  • V2ではF1, F2, F3, B1, B2, B3すべてのプライマーに対して一括で"5'側"、"3'側"のMutation/Consensusを指定していました。

  • 一方、V3では各プライマーの"5'側"、"中間"、"3'側"の計18箇所に対して、別個にMutation/Consensusの指定が可能となりました。

  • 各プライマー18箇所の特異性の高低を利用して増幅の特異性を調整し、野生株、変異株を増幅率で区別するプライマーや共通に増幅検出するプライマーの設計に応用可能となりました。
 
 
PrimerExplorerV2 PrimerExplorerV3
PrimerExplorerV2 PrimerExplorerV3
※チェックボックス欄の上にある対象ほど、
特異性は高くなります。
ターゲット配列の長さ制限
ターゲット配列の長さが2001b以上の配列の場合、プライマーの設計は行えません。
【1】はじめに (動作環境)
【2】各画面の操作通常プライマーの設計ループプライマーの設計
【3】付録
【4】PrimerExplorerV3 主なバージョンアップ内容
【5】LAMP法プライマー設計の手引き PrimerExplorerV3 [PDF(1.7MB)]
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