LAMP法 設計支援ソフトウェア：PrimerExplorer Loop-Mediated Isothermal Amplification ホーム
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PrimerExplorerV3　操作説明
【1】はじめに （動作環境）
【2】各画面の操作（通常プライマーの設計／ループプライマーの設計）
【3】付録
【4】PrimerExplorerV3 主なバージョンアップ内容
【5】LAMP法プライマー設計の手引き PrimerExplorerV3 [PDF（1.7MB）]
2. 各画面の操作（通常プライマーの設計）
ループプライマーの設計 はこちら
1. ターゲット配列ファイル/プライマー情報ファイル指定画面
プライマーセット生成のターゲットとなる塩基配列をファイルから読み込ませます。

ファイル形式は、以下の塩基配列フォーマットに対応しています。
  1. テキスト形式（配列のみ）
  2. FASTA形式
  3. GenBank形式
 画面
　


[参照...]ボタンを押し、ご自分のパソコン上のターゲット配列ファイルをご指定ください。
またここでは、使用するパラメータセットを以下のタイプから選択出来ます。

  1. 自動判定
    ターゲット配列のGC含有量に応じてパラメータの初期設定値を変化させます。
    GC含有量が40%以下の場合は”ATリッチ”時のパラメータを、60%以上の場合は”GCリッチ”時のパラメータを、それ以外の場合は”通常”時のパラメータを適用します。

  2. 通常
    標準的な設計を行う際のパラメータです。

  3. ユーザ指定
    この右にある[参照...]ボタンを押し、ご自分のパソコン上のパラメータファイルをご指定ください。
    指定されたパラメータファイルの値を初期設定値とします。
    LAMP法プライマー設計支援ソフト画面で保存されたパラメータを再利用出来ます。
    無効な設定は無視され、指定の無い項目は”通常”時の値が採用されます。
LAMP法プライマー設計支援ソフト画面　[プライマー設計]ボタンを押しますと、LAMP法プライマー設計支援ソフト画面へと進みます。
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2. プライマー設計画面

プライマーの生成を行うための操作の基本的な流れはこのようになります。

  1. Range Optionの設定を行います。
  2. [Generate]ボタンを押して、プライマーを生成します。
  3. 表示ページを指定して、[Display]ボタンを押してプライマーの一覧表示を行います。
以下、画面の各構成部品について
　 画面
　
(1) Range Option ターゲットレンジ指定の取り扱い（ターゲットレンジについて）
Ignore Range
ターゲットレンジジ指定を無効にする。
Within F2-B2
ターゲットレンジがF2-B2間(F2、B2自身を含む)範囲に含まれる。
Bitween F1c-B1c
ターゲットレンジがF1c-B1c間(F1c、B1c自身を含まない)の範囲に含まれる。
Targeting Range
ターゲットレンジ
(2) [Generate] プライマーセットの生成を行う。
(3) [Number of Primers] 現在設定されている条件を満たす各プライマー(F1c、F2、F3、B1c、B2、B3、FIP,BIP)の候補数を表示する。
(4) [F2/B2 List] 現在設定されている条件を満たすF2およびB2候補の一覧表示する。
(5) [Display] プライマーの一覧表示をWebブラウザの別画面として行う。
(6) Show Page 別画面に表示するプライマー一覧表示のページを選択する。
(7) Sorting Rule プライマーセットを出力順序を指定する。
Dimer
ダイマー安定性、ダイマー形成能が低い順
F2 5'position
プライマー位置、F2の5'末端の位置がターゲットの5'末端に近い順
F2-B2 range
増幅領域長、F2-B2間の領域（プライマー自身を含む）が短い順
Mutation(S)
[ascendant order]
突然変異部位を含むプライマーが少ない順
Mutation(S)
[descendent order]
突然変異部位を含むプライマーが多い順
5'/3' edge stability
末端安定性の低い順
Randam
順不同
(8) Set Mutation 本ソフトウェアでは突然変異部位と指定した領域を避けてプライマー候補を生成する。
塩基配列をマウスで選択し、[Mut/Cons]ボタンをクリックすると、配列の下の[*]表示が[-]に変わる。その[-]の領域が突然変異部分と認識される。
[Clear]ボタンで全て[*]の状態に戻る。
(9) Fixed Primer あらかじめ任意のプライマー位置を指定し候補を生成する。
塩基配列をマウスで選択し、クリックすると、プライマー指定位置が表示される。
各パラメーターは、直接数値を入力出来ます。 入力エリアの両脇に[-]、[+]のボタンが付いているものは、このボタンを押すことで入力値が+1もしくは-1されます。 また、設定したパラメータセットは、ご自分のパソコンに保存して、次回のプライマー設計に再利用することができます。
(10) Parameter Set パラメータセットを切り替える。
Normal
通常用のパラメータセットに切り替える。
AT rich
ATリッチ用のパラメータセットに切り替える。
GC rich
GCリッチ用のパラメータセットに切り替える。
Custom
ユーザによって指定されたパラメータセットに切り替える。
ターゲット配列ファイル指定画面でパラメータセットで”ユーザ指定”が選択された場合のみこの項目が現れる。
(11) Save Parameters 現在設定中のパラメータセットを、ファイルとして保存する。
保存されたパラメータセットは、ターゲット配列ファイル指定画面で”ユーザ指定”が選択することで再利用出来るようになる。
Basic Setting
(12) Length プライマーの長さの最短、最長
(13) Tm プライマーのTm値の最低、最高
(14) Distances プライマー間距離の最短、最長（位置関係について）
(F2-B2)
F2-B2間距離(プライマー自身を含む)、増幅領域長
Loop(F1c-F2)
F1c-F2間距離(F2のみ含む)、ループ長、B1c-B2間にも適用される。
F2-F3
F2-F3間距離(プライマー自身を含まない)、B2-B3間にも適用される。
F1c-B1c
F1c-B1c間距離(プライマー自身を含まない)
Advanced Setting
(15) Limitations プライマーセットを生成する際の組み合わせ数の上限
F1c/B1c
FIP(BIP)を生成する際に、ひとつのF2(B2)に組み合わせるF1c(B1c)の数
F2/B2
FIP(BIP)を生成する際に、ひとつのF1c(B1c)に組み合わせるF2(B2)の数
F3/B3
一組のFIP/BIPのセットに対して選択されるF3/B3(Outer Primer)の数
Sets
最終的に出力するプライマーセットの数
(16) dG threshold[Kcal/mol] dG閾値
5'stability
5'末端安定性（5'末端の安定性（dG）がこの値以下のプライマーを候補とする。）
3'stability
3'末端安定性（5'末端の安定性（dG）がこの値以下のプライマーを候補とする。）
v dimer check
ダイマー形成能（各プライマー間の安定性（dG）がこの値以上のプライマーを候補とする。）
(17) Mutation/Consensus 通常は突然変異部位がプライマー位置にかからないようにプライマー候補を生成するが、このチェックを入れると、突然変異部位がプライマー候補の5’端もしくは3‘端にある場合、許容する。
(18) GC rate(%) GC含量の許容範囲
(19) Experimental Conditions 実験条件
oligo[microM]
オリゴ濃度(μM)
Na+[mM]
Na+イオン濃度(mM)
Mg2+[mM]
Mg2+イオン濃度(mM)
(20)
 Reset Parameter パラメータを初期値に戻す。
　 　
使用上の注意
本システムでプライマーを設計出来るターゲット配列の配列長は2000塩基までです。
2000塩基を超えるターゲット配列が指定された場合、下図のような状態になり、メッセージ表示エリアに"Target sequence length is too long! Please input the sequence less than 2000bp."と表示され、パラメータ設定領域が非表示となりプライマーの設計は行えません。
画面
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3. プライマー一覧表示画面
生成したプライマーを100セット毎に一覧表示を行います。

各行が一つ一つのプライマーセットを意味し、各プライマー断片がターゲット上でどの位置に存在しているかをターゲット塩基配列と比較しながら確認できるようになっています。
[Detail]ボタンを押すと現在表示中のプライマーセットの詳細画面をWebブラウザの別画面で表示します。
各プライマーセットの左端にあるチェックボックスをチェックしてあるプライマーセットが詳細画面で表示されます。		 画面
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4. プライマー詳細表示画面

一覧表示画面でチェックしたプライマーセットの詳細表示を行います。

各プライマーセットについて以下の断片情報を表示しています。

  • F3
  • F2
  • F1c
  • B1c
  • B2
  • B3
  • FIP
  • BIP
画面
　


各プライマー断片につき以下の情報を表示しています。

  • プライマー断片名称
  • プライマー断片5'末端のターゲット塩基配列上での位置
  • プライマー断片3'末端のターゲット塩基配列上での位置
  • プライマー断片の長さ
  • プライマー断片のTm値
  • プライマー断片の5'末端安定性(dG)
  • プライマー断片の3'末端安定性(dG)
  • プライマー断片のGC含有率
  • プライマー断片の塩基配列

[Confirm]ボタンを押すと、各プライマーセットの左端にあるチェックボックスをチェックしてあるプライマーセットのみを抽出して詳細情報がWebブラウザの別画面で表示されます。
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5. 選択プライマー表示画面
プライマー詳細表示画面で選択されたプライマーを表示します。

[Order]ボタンを押すことで、それぞれのプライマーセット(6セット単位)の発注画面を呼び出せます。
[Primer Infomation]ボタンを押すことで、そのプライマー情報ファイルをPCに保存することが出来ます。
このプライマー情報ファイルを使用することでループプライマーの設計を行うことができます。		 画面
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6. プライマー発注画面
eGenomeOrederにてプライマーの発注を行います。

eGenomeOrderのIDとパスワードを入力してください。		 画面
【1】はじめに （動作環境）
【2】各画面の操作（通常プライマーの設計／ループプライマーの設計）
【3】付録
【4】PrimerExplorerV3 主なバージョンアップ内容
【5】LAMP法プライマー設計の手引き PrimerExplorerV3 [PDF（1.7MB）]
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