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各プライマー断片のTm値は、下記の式1により計算します。式1における ΔH,
ΔSといった各種エネルギー値はnearest-neighbor法(1)により計算します。
式1) Tm = ΔH ×1000/(ΔS + R ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+]
(各変数)
| R |
： |
気体定数 = 1.987 cal/(mol-deg) |
| ΔH |
： |
enthalpy (kcal/mol) |
| ΔS |
： |
entropy (eu) |
| C |
： |
oligonucleotide濃度(M) |
| [Na+] |
： |
ナトリウムイオン濃度(M) |
| ※ |
C/4は対象塩基配列がNon-self-complementaryの時使用します。
self-complementaryの時はCに置換します。 |
| ※ |
Mg濃度はNa濃度に換算します。 |
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[Na+]Mg = 4 [Mg2+]raw(1/2)
[Na+]adjusted = [Na+]raw
+ [Na+]Mg |
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本項では末端安定性(3' or 5')は下記の式2により計算します。
Nearest neighbor法により、末端(3' or 5')の6塩基につきΔG(free energy)を計算し、安定性を見ます。
安定性の基準としてΔG≦-5kcal/molのとき安定とします。また、この基準値は変更可能とします。
| ※ |
ΔG計算に用いるパラメータは論文(2)の値を参照してください。
また、ΔG計算の際にmismatch(塩基対が相補的でない状態。
例 A対G、C対A)が生じた時に用いる値は、論文(3、4、5)を参照してください。 |
式2) ΔG(total) = ΣΔG(i) + ΔG(Init.w/term.G-C) + ΔG(Init.w/term.A-T)
+ ΔG(sym)
| ※ |
前提条件：
塩基配列を2塩基ずつに分割します。対象塩基配列(塩基数N)のn番目(1≦n≦N)の塩基をn(i)、得られる配列をseq(i)とします。つまりseq(i)
= n(i) + n(i+1);(ただし1≦i≦N-1)となります。また、seq(i)と対をなす塩基配列をrev_seq(i)とし、それらが対になった時のfree
energyをΔG(i)とします。(必ずしもrev_seq(i)はseq(i)と相補的ではありません)
例）GAACCTG → GA, AA, AC, CC, CT, TG
| Sequence |
seq(1) |
seq(2) |
seq(3) |
seq(4) |
seq(5) |
seq(6) |
| GAACCTG |
GA |
AA |
AC |
CC |
CT |
TG |
|
(各変数)
| ΔG(total) |
： |
自由エネルギーの合計値 |
| ΔG(i) |
： |
seq(i)の自由エネルギー |
| ΔG(Init.w/term.G-C) |
： |
末端(5' or 3')がG or Cのときのinitiation parameter |
| ΔG(Init.w/term.A-T) |
： |
末端(5' or 3')がA or Tのときのinitiation parameter |
| ΔG(sym) |
： |
symmetry correction。
塩基配列がself-complementaryの時の補正値。
| ※ |
initiation parameterは塩基配列の両末端に適用する。 |
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例1) 5' - AGGCTT - 3' |
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ΔG(total) = ΣΔG(i) + 2ΔG(Init.w/term.A-T) |
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例2) 5' - AGGCTG - 3' |
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ΔG(total) = ΣΔG(i) + ΔG(Init.w/term.A-T)
+ ΔG(Init.w/term.G-C) |
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| 参考文献 |
| (1) |
John SantaLucia,Jr. et.al (1996) Biochemistry
35,3555-3562 |
| (2) |
John SantaLucia,Jr. (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA
95,1460-1465 |
| (3) |
Hatim T.Allawi and John SantaLucia,Jr. (1998)
Biochemistry 37,2170-2179 |
| (4) |
Hatim T.Allawi and John SantaLucia,Jr. (1998)
Biochemistry 37,9435-9444 |
| (5) |
Nicolas Peyret,P. Ananda Seneviratne,Hatim T.Allawi
et.al. (1998) Biochemistry 38 |
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プライマー情報ファイルとは
ループプライマーは、LAMP法（迅速法）においてLAMP標準法のプライマー（FIP,BIP,F3,B3）に追加して使用されます。
そのため、ループプライマー設計のためにはターゲット配列のみならず、FIP,BIP,F3,B3のターゲット配列上での位置情報が必要となります。
本ソフトウェアでは以上の情報をプライマー情報ファイルの形式で入力します。
プライマー情報ファイルの作成方法
選択プライマー表示画面からプライマー情報ファイルをダウンロードしてください。
（操作手引書の選択プライマー 表示画面を参照してください。） |
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